RAF家族激酶是细胞增殖的关键调节剂，为EGFR或小GTP激酶 RAS的下游蛋白，常见的信号通路为RAS–RAF–MEK–ERK途径。通常通过突变RAS或RAF使其功能激活，使得下游靶蛋白过度磷酸化，导致通路信号失调，最终引起癌症的发生和发展。其中BRAF（V600E）是目前研究的重要靶点，临床上使用dabrafenib，vemurafenib和encorafenib等靶向抑制剂治疗相关疾病。虽然这些抑制剂显示出了抗BRAF（V600E）驱动肿瘤的活性，但由于RAS和EGFR等成分仍然存在，后期依然会通过RAS-ERK途径的信号促进肿瘤生长。此外，由于RAF蛋白容易二聚化，会导致这些药物治疗效果降低。因此，急需一类能克服这些问题的新药。近期，加拿大多伦多大学的研究团队通过开发靶向BRAF（V600E）的PROTAC分子，提出了一种新型抑制BRAF（V600E）驱动的癌症治疗的概念。
研究人员首先利用FDA已批准的或者上在临床前研究的BARF V600E的靶向抑制剂dabrafebib和BI 882370化合物与三种不同的E3泛素连接酶粘合剂（pomalidomide,thalidomide和VH023）进行排列组合以及中间连接片段长度和连接位点的筛选，最终确定了能够靶向降解BARFV600E的P4B以及阴性Protac分子P4BMe。在对于BARF家族中的其他蛋白进行筛选发现，P4B能够专一性降解BARF V600E蛋白，并且降低了源头化合物BI 882370的脱靶效应。
研究人员随后利用黑色素瘤细胞A375(纯和BARF V600E突变)确认了P4B确实可以靶向降解 BRAF V600E蛋白，以及对下游ERK和MEK的磷酸化有显著的抑制作用。并且通过利用MLN4924:类泛素化抑制剂；MG-132：蛋白酶体抑制剂；Pomalidomide：E3泛素连接酶粘合剂和蛋白泛素化检测，证明了P4B通过给BRAF V600E蛋白标记泛素化并通过蛋白酶体途径进行降解。
研究人员横向对比了Protac阳性分子P4B，阴性分子P4BMe和源头化合物BI 882370的作用效果，发现P4B在抑制细胞增殖和降低下游蛋白磷酸化方面更好。但在持续作用效果方面，P4B并不能长效抑制下游蛋白的磷酸化，相反BI 882370的有效作用时间更长。然而利用SPR技术分析这些化合物和蛋白的亲和力并没有显著的差别。因此，化合物在效果作用时间差异方面可能存在别的机制。
研究人员在其他BRAF不同类型的细胞检测了P4B的作用效果，发现在BRAF V600D和G466V突变体细胞中是有效的，尤其是在vemurafenib抗性细胞株A375-VR（其中一条染色体串联突变）是有效的，说明P4B有望克服之前抑制剂耐药问题。之前实验的所有细胞系都是RAS WT型的细胞。临床上的抑制剂都是可以激活RAS，并且将BRAF V600E由单体状态转化二聚体状态，最终对这些抑制剂产生抗性。研究人员在将BRAF V600E细胞中的RAS敲出之后，P4B的功能不受影响.但RAS突变激活之后，P4B抑制细胞的增殖效果和降低下游蛋白的磷酸化效果都大大降低。因此，RAS的突变激活能够使得细胞激活对P4B抵抗作用。
但P4B 在BRAF其他突变体以及野生型（WT）中是几乎无效的。P4B抑制细胞的增殖效果和降低下游蛋白的磷酸化效果都大大降低。为了探究P4B在BRAF V600E和WT之间的区别，利用IP实验发现P4B拉下蛋白中BRAF V600E多于BRAF WT。但在FP实验中，却发现P4B和E3泛素连接酶（CRBN）以及BRAF V600E/BRAFWT三元复合物的结合并没有明显差异。MEK可以结合BRAF以影响P4B的结合，当体系中加入MEK以及突变体MEK（F311S），FP实验证明P4B降解BRAF V600E和BRAFWT之间的差异是由于MEK的结合。
这项工作证明了PROTAC分子P4B能够治疗某些抗传统抑制剂治疗的BRAF突变驱动的细胞系的应用前景，并且对于目前临床上尚无药物的BRAF串联突变细胞系也是有一定效果，将来可以补充这方面的空白。另外，这项工作系统的阐明了P4B受MEK和BRAF WT相互作用倾向于降解BRAF V600E的作用机制，以及RAS的激活将BRAF V600E由单体状态转向二聚体状态从而阻断P4B的作用效果。未来如果利用中间连接片段或者新型E3泛素连接酶的粘合剂能够将BRAF V600E固定在单体状态，将大大拓展PROTAC分子P4B的作用范围以及未来临床应用前景。
参考文献
Posternak, G., Tang, X., Maisonneuve, P. etal. Functional characterization of a PROTAC directed against BRAFmutant V600E. Nat Chem Biol (2020).
110102000668（1）号